2. Biosynthese:
2.1. Allgemeines:
Die Hydroperoxi- und Hydroxieicosatetraensäuren werden durch eine Oxidation der Arachidonsäure (5,8,11,14-Eikosatetraensäure) dargestellt. Dies kann enzymatisch mit Hilfe der Lipoxigenasen (2), mit molekularem Sauerstoff (3) oder durch Autoxidation (4) geschehen (13).
In biologischen Systemen treten jedoch enzymatische Reaktionen auf, die die wegen ihrer oxidierenden Wirkung schädlichen Hydroperoxide durch Peroxidasen zu entsprechenden Hydroxiden reduzieren. Dort kommt daher normalerweise in stabiler Form nur Hydroxieikosa-tetraensäuren vor, da das regelmäßig vorhandene Enzym Katalase die Hydroperoxide, also auch die Hydroperoxieikosatetraensäuren, reduziert. Dies führt dazu, das sich in biologischen Materialien Hydroperoxisäuren nur schwer nachweisen lassen. Hydroperoxieikosatetraensäuren lassen sich daher kaum aus biologischen Systemen gewinnen, sondern nur in isolierten Systemen darstellen (9,17).
In biologischem Material, wie z. B. Blutplättchen, konkurriert die Lipoxigenase mit der auch vorhandenen Cyclooxigenase um die Arachidonsäure (2,6). Um nichtcyclische oxidierte Arachidonsäuremetabolite zu gewinnen, muß daher die Cyclooxigenaseaktivität gehemmt werden. Durch Zugabe von nichtsteroidalen Antiphlogistika (Entzündungshemmer), wie Acetylsalicylsäure (bekannter Markenname: Aspirin (Firma Bayer AG)) oder Indomethacin in einer molaren Konzentration von 0.1 μM, läßt sich die Cyclooxigenaseaktivität hemmen.(2). Die Hemmung der Cyclooxigenase soll durch eine Acetylierung des aktiven Zentrums des Enzyms bewirkt werden (6).
Bei der Darstellung der Hydroxieikosatetraensäuren aus biologischen Materialien stammt die Arachidonsäure, soweit sie nicht zusätzlich zugefügt wurde, aus membrangebundenen Phospholipiden. Aus diesen wird sie mit Hilfe der Phospholipase A2 freigesetzt. Bevorzugtes Substrat ist das membrangebundene Phospholipid Phosphatidylcholin (Lecithin), das in größeren Mengen am C-Atom 2 veresterte Arachidonsäure enthält (7). Bei dieser Reaktion entsteht eine konjugierte cis,trans-Doppelbindung (8).
2.2. Vorkommen der einzelnen Hydrooxieikosatetraensäuren:
Zuerst hat man geglaubt, daß die Lipoxigenaseprodukte rein pflanz-liche Stoffwechselprodukte, Cyclooxigenaseprodukte ausschließlich tierische Metabolite seien. Doch dies stellte sich 1974 durch Hamberg und Samuelsson (2) als Irrtum heraus. Sie fanden zuerst 12-Hydroxieikosatetraensäure in Blutplättchen. Tierische Lipoxigenase läßt sich bis heute nicht isolieren (14). Ihre Reaktionen lassen sich bisher nur im Zellverband untersuchen. Dabei wird, wie oben erwähnt, die Hydroperoxieikosatetraensäure durch zelluläre Peroxidase in die stabilere Hydroxieikosatetraen-säure reduziert (9,17).
Daher ist es noch nicht auf einfache Weise möglich, Hydroperoxi-eikosatetraensäure zu isolieren; eine Ausnahme bildet insoweit die 15-Hydroperoxieikosatetraensäure. Diese läßt sich durch Sojabohnen-Lipoxigenase in einem System darstellen, das keine Peroxidasen enthält.
Zwar wird beschrieben (6), daß die Gabe von Acetylsalicylsäure in hohen Dosen nicht die Lipoxigenase sondern die enzymatische Reduktion der Peroxidase hemmt. Dieser vielleicht gegebene Weg zur Hydroperoxid-Darstellung kommt aber für das gewählte Verfahren schon wegen der eigenen UV-Aktivität der Acetylsalicylsäure in Betracht.
Die Hemmung der Peroxidase soll nämlich in gewaschenen Thrombozyten erst bei einer Dosis von 3 mM Acetylsalicylsäure auftreten. Im Plättchen-reichen-Plasma (PRP) tritt dieser Effekt schon bei wesentlich geringeren Dosen auf.(6)
Zwar wird bei der Biosynthese der 12-Hydroxieikosatetraensäure Acetylsalicylsäure zur Hemmung der Cyclooxigenase eingesetzt (s. unter 2.3. (S. 7)); die hierzu benötigte Dosis ist jedoch so gering, daß der soeben dargestellte Effekt nicht eintreten kann.
Bei der Erforschung der Enzymsynthese hat man festgestellt, daß die Lipoxigenase gewebespezifisch reagiert. So oxidiert bzw. peroxidiert z.B. die Lipoxigenasen der Lunge an C-11, C-12 und C-15 (11), die der Thrombozyten an C-12 (2,6,7,9, 10,14,15), die der Leukocyten an C-5 (7,8,9,10), C-8 und C-9 (15), C-12 (10) und C-15 (9,10), die der Makrophagen an C-5 (9) und Gehirn, Haut und Milz an C-12 (7,17).
Insgesamt sind acht Monohydroperoxi- bzw. Monohydroxiisomere möglich (3). Hiervon lassen sich sechs Isomere durch UV-Detektion bei etwa 235 nm nachweisen, da nur diese konjugierte Doppelbindun-gen aufweisen; es handelt sich um die 5-, die 8-, die 9-, die 11-, die 12- und die 15-Hydroxieikosatetraensäure (3,15).
Die Strukturformeln sind im zweiten Bild im Anhang dargestellt.
Insgesamt ergibt sich folgende, keine Vollständigkeit beanspruchende Tabelle:
| Substanz | Gewebe | Referenz |
|---|---|---|
| 5-HETE | Leukocyten, Makrophagen | (7,8,9,10) |
| 8-HETE | Leukocyten | (15) |
| 9-HETE | Leukocyten | (15) |
| 11-HETE | Lunge | (11) |
| 12-HETE | Lunge, Thrombozyten, Leukocyten, Gehirn, Haut, Milz | (2,6,7,9,10,11,14,15,17) |
| 15-HETE | Leukocyten, Sojabohne, Meerschweinchen-Lunge | (9,10,11) |
2.3. Biosynthese von 12-Hydroxieikosatetraensäure:
Zur Isolierung von 12-Hydroxieikosatetraensäure eignen sich besonders die Thrombozyten. Die Thrombozyten sind Blutkörperchen, von denen das menschliche Blut 150000 bis 400000 pro µl enthält. Sie sind wichtig bei der Blutgerinnung. Eine krankhafte Abweichung ist die Thrombose, d.h. der Verschluß von Adern durch aggregierte Thrombozyten.
Die Thrombozyten bilden - wie aus der obigen Tabelle hervorgeht - ausschließlich die 12-Hydroxieikosatetraensäure. Sie sind zudem leicht zu gewinnen. Die normalerweise gleichzeitig wirkende Cyclooxigenase wird durch Zugabe von 0.1 mM Acetylsalicylsäure gehemmt (6). Zugleich wird die Thrombozytenaggregation gehemmt (6), sodaß die eingestellte Thrombozytendichte stabilisiert wird.
Die Bildung von 12-Hydroxieikosatetraensäure hat ihr pH-Optimum bei pH 7.0-7.4 (2,6,11,14). Durch Zugabe von zusätzlicher Arachidonsäure lassen sich auch hier größere Mengen ( Mikrogramm-Bereich ) gewinnen und isolieren.
2.4. Synthese von 15-Hydroperoxieikosatetraensäure:
15-Hydroperoxieikosatetraensäure läßt sich in einem isolierten System gewinnen. Eine aus Sojabohnen isolierte 15-Lipoxigenase, die im Handel erhältlich ist, ist spezifisch für die Oxidation am C-Atom 15 der Arachidonsäure. Durch dieses Enzym wird eine Oxidation mit molekularem Sauerstoff katalysiert. Es ist also möglich, 15-Hydroperoxieikosatetraensäure in fast reiner Form in größeren Mengen (Milligramm-Bereich) darzustellen. (19)
Diese Reaktion wird in einem Borat-Puffer bei pH 9.0 durchgeführt (12,13,19).
2.5. Synthese von 15-Hydroxieikosatetraensäure:
Die 15-Hydroxieikosatetraensäure läßt sich in reiner Form mit Hilfe der Lipoxigenase aus Sojabohnen darstellen (19). Dabei entsteht sie als Endprodukt. Die aus der enzymatischen Reaktion entstehende 15-Hydroperoxieikosatetraensäure ist lediglich zu reduzieren. Diese Reaktion läßt sich mit einem milden Reduktionsmittel wie z.B: Natriumborhydrid durchführen (19). Zwar kommt als Reduktionsmittel auch Lithiumaluminiumhydrid in Frage, dies ist jedoch teurer.
Auf diese Weise läßt sich auch 15-Hydroxieikosatetraensäure in fast reiner Form in Milligramm-Mengen darstellen.
15-Hydroperoxieikosatetraensäure und 15-Hydroxieikosatetraensäure lassen sich auch mit Hilfe der HPLC unterscheiden, da die Hydroperoxiform eine etwas geringere Polarität hat als die Hydroxiform.