5. Ergebnisse:
5.1. Lösungsmittelzusammensetzung:
Die Versuche zur Lösungsmittelzusammensetzung (beschrieben unter 3.5.) hatten das Ziel, eine kurze Retentionszeit bei einer optimalen Trennung der zu untersuchenden Substanzen zu erreichen. Als optimal wurde eine Trennung angesehen, bei denen die von den Substanzen verursachten Peaks derart von einander getrennt sind, daß zwischenzeitlich die Basislinie erreicht wird.
Als Resultat ergab sich, daß eine Mischung von 55 Vol.% Acetonitril in 0.05 %iger wäßriger Ethansäure zu einer guten Trennung der zu untersuchenden Substanzen in einer angemessenen Retentionszeit führt.
5.2. Retentionszeiten:
Bei der soeben angegebenen Lösungsmittelzusammensetzung ergaben sich folgende Retentionszeiten:
| Substanz | Retentionszeit |
| 15-Hydroxieikosatetraensäure | 12.8 min |
| 15-Hydroperoxieikosatetraensäure | 14.4 min |
| 12-Hydroxieikosatetraensäure | 14.8 min |
Diese Werte wurden mit externen Standards überprüft. Es ergab sich eine Bestätigung der ermittelten Retentionszeiten.
Die vorhandenen Literaturdaten konnten die Reihenfolge der Hydroxieikosatetraensäuren bestätigen (20,21,22,23). Im übrigen sind sie unergiebig, da die Verfasser eine Gradientenelution durchführten und sich daraus eine andere Lösungsmittelzusammensetzung ergab. Die sich hieraus ergebende, erheblich längere Retentionszeit sollte eine bessere Trennung der genannten Substanzen und anderer Arachidonsäure-Metaboliten bewirken.
5.3. Abhängigkeit der Hydroxieikosatetraensäure- und Hydroperoxieikosatetraensäure-Bildung von der Enzymkonzentration:
5.3.1. 15-Hydroxieikosatetraensäure:
Die Reihenversuche zur Bestimmung der Abhängigkeit der Bildung der 15-Hydroxieikosatetraensäure von der Enzymkonzentration (beschrieben unter 3.6.1.) hatten die im Folgenden dargestellten Ergebnisse. Insgesamt wurden fünf Versuchsreihen durchgeführt.
Dabei bedeuten im Folgenden:
- LOG - Lipoxigenase,
- Area - die vom Integrator berechnete Fläche unter dem zu bestimmenden Peak und
- VR - Versuchsreihe.
| 1. VR | 2. VR | 3. VR | 4. VR | 5. VR | |
|---|---|---|---|---|---|
| µg LOG | Area | Area | Area | Area | Area |
| 0 | 7400 | 10500 | 18000 | 20900 | 5900 |
| 10 | 360000 | 670000 | 749000 | 74300 | 296000 |
| 20 | 816000 | 765000 | 810000 | 738000 | 747000 |
| 30 | 902000 | 869000 | 731000 | 785000 | 840000 |
| 40 | 274000 | 695000 | 743000 | 830000 | 659000 |
| 50 | 292000 | 405000 | 290000 | 460000 | 311000 |
| 60 | 191000 | 308000 | 261000 | 282000 | 207000 |
| 70 | 252000 | 283000 | 114000 | 195000 | 216000 |
| 80 | 61000 | 128000 | 34000 | 153000 | 90000 |
| 100 | 164000 | - | 20000 | 80000 | 60000 |
Das arithmetische Mittel der Areas errechnet nach der Formel
und ist in der nachstehenden Tabelle aufgeführt:
| µg |  |
|---|---|
| 0 | 12500 |
| 10 | 564000 |
| 20 | 775000 |
| 30 | 825000 |
| 40 | 638000 |
| 50 | 352000 |
| 60 | 250000 |
| 70 | 212000 |
| 80 | 93000 |
| 100 | 81000 |
Die Standardabweichung der Areas berechnet nach der Formel
ist in der folgenden Tabelle angeführt:
| µg LOG | σ |
|---|---|
| 0 | 5900 |
| 10 | 195000 |
| 20 | 32100 |
| 30 | 60900 |
| 40 | 190900 |
| 50 | 68700 |
| 60 | 44300 |
| 70 | 57500 |
| 80 | 43200 |
| 100 | 52600 |
Die Werte wurden mit einem kurzen Basic-Programm errechnet, das in der Anlage als Programm 1 wiedergegeben ist.
Zur quantitativen Bestimmung der entstandenen Menge an 15-Hydroxieikosatetraensäure aus der zugegebenen Menge an Arachidonsäure mit Hilfe der Lipoxigenase wurde ein externer Standard herangezogen. Anhand dieses Standards wurde festgestellt, daß 20 ng 15-Hydroxieikosatetraensäure in 20 µl Methanol eine vom Integrator berechnete Fläche unter dem zu bestimmenden Peak (Area) von 60.000 ergab. Daraus lassen sich mit den oben angegebenen Flächen unter Berück-sichtigung der unterschiedlichen Volumina die entstandene Masse an 15-Hydroxieikosatetraensäure in µg bestimmen. Diese Berechnung erfolgte nach der Formel:
Folgende Werte wurden errechnet:
| 1. VR | 2. VR | 3. VR | 4. VR | 5. VR | |
|---|---|---|---|---|---|
| µg LOG | m | m | m | m | m |
| 0 | 0.142 | 0.202 | 0.334 | 0.402 | 0.114 |
| 10 | 6.996 | 13.020 | 14.029 | 14.439 | 5.752 |
| 20 | 16.007 | 15.008 | 15.890 | 14.477 | 13.322 |
| 30 | 16.236 | 18.003 | 14.474 | 15.543 | 13.632 |
| 40 | 5.475 | 13.888 | 14.668 | 16.586 | 13.169 |
| 50 | 5.889 | 8.168 | 5.484 | 9.277 | 6.272 |
| 60 | 3.887 | 6.268 | 5.311 | 5.739 | 4.212 |
| 70 | 5.147 | 5.811 | 2.652 | 4.004 | 4.435 |
| 80 | 1.264 | 2.652 | 704 | 3.170 | 1.864 |
| 100 | 3458 | -- | 422 | 1.687 | 1265 |
Diese Werte wurden ebenfalls mit einem kurzen Basic-Programm bestimmt. Dies ist in der Anlage als Programm 2 wiedergegeben.
Auch aus diesen Masse-Werten lassen sich das arithmetische Mittel und die Standardabweichung bestimmen.
| µg LOG | | σ |
|---|---|---|
| 0 | 0,239 | 0,111 |
| 10 | 10,847 | 3,702 |
| 20 | 15,541 | 1,580 |
| 30 | 16,178 | 1,170 |
| 40 | 12,757 | 3,815 |
| 50 | 7,091 | 1,386 |
| 60 | 5,083 | 0,903 |
| 70 | 4,353 | 1,181 |
| 80 | 1,931 | 0,896 |
| 100 | 1,708 | 1,108 |
Die graphische Darstellung der Mittelwerte und der Standardabwei-chungen befindet sich als Zeichnung 1 im Anhang.
Außerdem kann noch die relative Produktmenge aus dem Verhältnis 15-Hydroxieikosatetraensäure/eingesetzte Arachidonsäure in Abhängigkeit von der zugegebenen Enzymmasse bestimmt werden (vergl. a. Zeichnung 2).
| µg LOG |  |
|---|---|
| 0 | 0,48 |
| 10 | 21,69 |
| 20 | 31,08 |
| 30 | 32,36 |
| 40 | 25,51 |
| 50 | 14,18 |
| 60 | 10,17 |
| 70 | 8,71 |
| 80 | 3,86 |
| 100 | 3,42 |
Dabei wurden folgende Abkürzungen verwandt:
- HETE - Hydroxieikosatetraensäure
- AA - Arachidonsäure
Es ergibt sich eine maximale Ausbeute von etwas mehr als 30 % bei einer Enzymmenge von 30 µg bezogen auf 50 µg Arachidonsäure. Eine Erhöhung der Enzymmenge bewirkt nicht nur keine weitere Steigung, sondern führt sogar zu einer rapiden Senkung der Ausbeute. Dies kann theoretisch auf zwei Wegen erklärt werden. In Betracht kommt zum einen eine Hemmung des Enzyms. Zum anderen ist an eine Fortsetzungsreaktion zu denken.
Daß auch ohne Enzymgabe Umsatz feststellbar ist, kann durch eine Autoxidation erklärt werden.
Mit dem als Programm 3 im Anhang abgedruckten Basic-Programm wurde aus den Mittelwerten der Massen ein Ausgleichspolynom errechnet.
Dieses lautet:
y = – 0,02024 x2 + 1,13035 x + 0,76968
Bei der Berechnung dieses Polynoms wurden die ersten sechs Werte (bis 50 µg Lipoxigenase einschließlich) berücksichtigt. Der weitere Kurvenverlauf läßt sich sinnvoll nur mit einer Exponentialfunktion näherungsweise beschreiben.
Mit dem als Programm 4 im Anhang wiedergegebenen Basic-Programm wurde der Verlauf der aus dem Polynom entwickelten Kurve mit der im Anhang als Abbildung 3 dargestellten Graphik verglichen.
Das rechnerisch ermittelte Maximum des Polynoms liegt bei 27.92 µg Lipoxigenase. Hierbei sollen 16.55 µg 15-Hydroxieikosatetraensäure entstehen.
5.3.2. 15-Hydroperoxieikosatetraensäure:
Die Überprüfung durch eine Stichprobe ergab, daß der Kurvenverlauf einer Versuchsreihe, bei der lediglich 15-Hydroperoxieikosatetraensäure gebildet wurde, den Ergebnissen der Reihenversuchen, bei denen durch Reduktion 15-Hydroxieikosatetraensäure entstand, entspricht.
5.3.3. 12-Hydroxieikosatetraensäure:
Die Reihenversuche zur Bestimmung der Abhängigkeit der Bildung der 12-Hydroxieikosatetraensäure von der Enzymkonzentration - ausgedrückt als Anzahl der Thrombocyten - (beschrieben unter 3.6.3.) hatten die im Folgenden dargestellten Ergebnisse. Auch hier wurden insgesamt fünf Versuchsreihen durchgeführt.
Dabei bedeuten im Folgenden:
- Thr/A - Thrombocytenzahl pro Ansatz,
- Area - die vom Integrator berechnete Fläche unter dem zu bestimmenden Peak und
- VR - Versuchsreihe.
| 1. VR | 2. VR | 3. VR | 4. VR | 5. VR | |
|---|---|---|---|---|---|
| Thr/A | Area | Area | Area | Area | Area |
| 0 | 15500 | 15400 | 15400 | 2600 | -- |
| 1⋅107 | 18600 | 38000 | 47000 | 25000 | 31000 |
| 2⋅107 | 45400 | 45300 | 66000 | 46000 | 39500 |
| 4⋅107 | 54000 | 80000 | 77000 | 103000 | 72000 |
| 8⋅107 | 128000 | 132000 | 123000 | 131000 | 154000 |
| 1,6⋅108 | 222000 | 134000 | 294000 | -- | 179000 |
Das arithmetische Mittel X und die Standardabweichung σ der Areas sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt:
| Thr/A | | σ |
|---|---|---|
| 0⋅107 | 12275 | 5586 |
| 1⋅107 | 31920 | 9905 |
| 2⋅107 | 48440 | 9092 |
| 4⋅107 | 77200 | 15740 |
| 8⋅107 | 134200 | 10127 |
| 1,6⋅108 | 207250 | 58963 |
Diese Werte wurden nach den oben angeführten Formeln und mittels des bezeichneten Programmes berechnet.
Auch bei der 12-Hydroxieikosatetraensäure konnten aufgrund des externen Standards Massen bestimmt werden. Bei diesen Versuchen brauchten keine unterschiedlichen Endvolumina berücksichtigt zu werden. Der 12-Hydroxieikosatetraensäure-Standard hatte für 20 ng in 20 µl eine Fläche (Area) von 42200. Die Umrechnung erfolgt nach folgender Formel
Auch für diese Berechnung wurde ein kleines Basic-Programm geschrieben, das im Anhang als Programm 5 abgedruckt ist.
Daraus errechnen sich also folgende Werte:
| 1. VR | 2. VR | 3. VR | 4. VR | 5. VR | |
|---|---|---|---|---|---|
| Thr/A | m | m | m | m | m |
| 0 | 0,221 | 0,220 | 0,223 | 0,037 | -- |
| 1⋅107 | 0,266 | 0,543 | 0,671 | 0,357 | 0,443 |
| 2⋅107 | 0,648 | 0,647 | 0,942 | 0,657 | 0,564 |
| 4⋅107 | 0,771 | 1,143 | 1,100 | 1,471 | 1,028 |
| 8⋅107 | 1,828 | 1,886 | 1,800 | 1,871 | 2,200 |
| 1,6⋅108 | 3,171 | 1,914 | 4,200 | -- | 2,557 |
Das arithmetische Mittel X und die Standardabweichung σ der Massen sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt:
| Thr/A | | σ |
|---|---|---|
| 0 | 0,173 | 0,080 |
| 1⋅107 | 0,456 | 0,141 |
| 2⋅107 | 0,692 | 0,130 |
| 4⋅107 | 1,103 | 0,225 |
| 8⋅107 | 1,917 | 0,145 |
| 1,6⋅108 | 2,960 | 0,842 |
Die dazugehörige graphische Darstellung befindet sich als Zeichnung 3 im Anhang.
Außerdem kann noch die relative Produktmenge aus dem Verhältnis der 12-Hydroxieikosatetraensäure zur eingesetzten Arachidonsäure in Abhängigkeit von der zugegebenen Anzahl an Thrombozyten bestimmt werden (vergl. a. Zeichnung 4).
| Thr/A | |
|---|---|
| 0 | 0,34 |
| 1⋅107 | 0,91 |
| 2⋅107 | 1,38 |
| 4⋅107 | 2,21 |
| 8⋅107 | 3,83 |
| 1,6⋅108 | 5,92 |
Es ergibt sich eine maximale Ausbeute von etwa 6 %, die jedoch wohl nicht den theoretischen Höchstwert darstellt.
Obwohl das theoretische Maximum der Ausbeute nicht gefunden werden konnte, ist aber festzustellen, daß die Steigerung des Umsatzes pro Thrombozytenquantität bei einer Erhöhung der Thrombozytendichte abnimmt. Der Kurvenverlauf ist asymtotisch, ohne daß die vorliegenden Werte den Grenzwert erkennen ließen. Durch eine Steigerung der Anzahl der Thrombozyten pro Ansatz ist theoretisch eine weitere Steigerung der Ausbeute denkbar. Eine wesentliche Erhöhung der Thrombozytendichte scheitert jedoch an deren Aggregationsneigung.
Der Kurvenverlauf läßt erkennen, daß die Ausgleichskurve wohl nicht parabolischer Natur ist. Die Errechnung eines Ausgleichpolynoms mit dem im Anhang als Programm 3 wiedergegebenen Basic-Programm ist zwar möglich, erscheint aber aus diesem Grund nicht sinnvoll.