4. Methoden:

4.1. Benötigte Lösungen und Chemikalien:

ACD Lsg.: Fertiglösung der Firma Biotest Pharma
          Zusammensetzung pro Liter:
                            13.2 g Natriumcitrat x 2 H2O
                             4.4 g Citronensäure
                            14.7 g Glucose x H2O

Waschpuffer:        0.113 M NaCl
                           0.004 M Na2HPO
                           0.024 M NaH2PO
                           0.004 M KH2PO
                           0.005 M Glucose

                            pH 6.5

Tris-NaCl-Lsg.:  0.140 M NaCl
                    0.015 M Tris (- hydroxymethylaminomethan
                          = 2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol)
                    0.005 M Glucose
 
                    mit HCl auf pH 7.4 eingestellt

Borat-Puffer:       0.1 M Borsäure, mit NaOH auf pH 9.0 eingestellt

Arachidonsäure-Lsg.:

Aus einer Stammlösung, die 10 mg Arachidonsäure pro ml Toluol enthält, werden die für den jeweiligen Versuch benötigten Mengen unter Stickstoff entnommen. Das Toluol wird unter Stickstoff entfernt und der Rückstand im gleichen Volumen 0.5 %iger methanolischer NaOH (gesättigte Lösung) aufgenommen. Das Methanol wird im Stickstoffstrom abgedampft und das so entstandene Na-Salz der Arachidonsäure im gewünschten Puffer aufgenommen. (5)

Acetylsalicylsäure:           M = 180 g/mol
(Aspirin)

Alle verwandten Chemikalien hatten - soweit erhältlich p.A.-Qualität.

4.2. Herstellung gewaschener Thrombozyten (28):

Venöses Blut von Freiwilligen wird in ACD (Biostabil, Fa. Biotest, Frankfurt) im Verhältnis 5:1 aufgenommen. Durch Zentrifugation (10 min, 300 x g (g = Erdbeschleunigung: 9.81 m/s2)) wird Plättchenrei-ches Plasma (PRP) hergestellt. Dieses wird anschließend 10 min bei 1600 x g zentrifugiert. Die noch vorhandenen Erythrozyten werden durch Zentrifugation (10 min, 300 x g) entfernt, und der Überstand wird nochmals 10 min bei 1600 x g zentrifugiert. Das Pellet wird in Tris gepufferter Kochsalzlösung pH 7.4 resuspendiert.

Die Anzahl der Thrombozyten wird mit einem Phasenkontrastmikroskop (Olympus, Tokio, Japan) unter Verwendung eines Thrombozytenzähl-mediums (Thromboplus, Sarstedt) in einer Thoma Zählkammer bestimmt.

4.3. Synthese von 12-Hydroxieikosatetraensäure mit gewaschenen Thrombozyten (17):

Um eine größere Menge 12-Hydroxieikosatetraensäure herzustellen wird folgender Reaktionsansatz durchgeführt: Dabei wird der Titer der Thrombozyten-Suspension mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung auf 200000/µl eingestellt (28). Diese Suspension wird nach Zugabe von Acetylsalicylsäure in einer Endkonzentration von 1x10-4 mol/l 60 min lang bei 37°C mit 15 µmol/l Arachidonsäure inkubiert. Durch Einstellen von pH 3 mit Eisessig wird die Inkubation abgestoppt.

Um die festen Bestandteile zu entfernen, wird die Suspension 5 min bei 300 x g zentrifugiert.

Der Überstand wird dreimal mit Diethylether (1/1; v/v) ausgeschüt-telt, die organischen Extrakte vereinigt und eingeengt (29).

Der Rückstand wird in 1 ml Methanol aufgenommen und durch HPLC charakterisiert.

4.4. Synthese von 15-Hydroperoxieikosatetraensäure und 15-Hydroxieikosatetraensäure (19):

Das Na-Salz von 4 mg Arachidonsäure wird in 100 ml 0.1 M Na-Borat-Puffer pH 9.0 von 0°C aufgenommen und die Reaktion durch Zugabe von 2 mg Lipoxygenase aus Sojabohne gestartet.

Nach 30 min wird mit konz. Essigsäure angesäuert und dreimal mit 20 ml Diethylether extrahiert. Die organischen Extrakte werden gereinigt, eingeengt und in 5 ml Methanol aufgenommen.

Diese methanolische Lösung wird bei 0°C mit 10 mg Natriumborhydrid reduziert (Reaktionszeit 20 min), mit Essigsäure angesäuert (pH 3) und mit Ether extrahiert. Die organischen Extrakte werden am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand in Methanol aufgenommen und durch HPLC charakterisiert.

4.5. Abhängigkeit der Hydroxieikosatetraensäure - Bildung von der Enzymkonzentration:

4.5.1. 15-Hydroxieikosatetraensäure:

1 mg Lipoxygenase aus Sojabohnen wird in 1 ml Borat-Puffer aufgenommen. Zu jeweils 1 ml reinen Borat-Puffer werden 50µl Arachidonsäure-Lsg. die 50 µg entsprechen, gegeben. Dann wird dem Reaktionsansatz 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 und 100 µl Enzymlösung, entsprechend 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 und 100 µg Lipoxygenase, zugefügt. Diese Lösung wird 30 min lang bei 0°C inkubiert.

Zu jeder Probe werden dann 1 mg NaBH4 zur Reduktion der gebildeten 15-Hydroperoxieikosatetraensäure gegeben. Die Proben werden noch-mals 30 min inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion wird zu jeweils 50 µl konz. Essigsäure vorsichtig 500 µl der Probe gegeben.

20 µl jeder Probe werden chromatographiert (HPLC) und der Gehalt an 15-Hydroxieikosatetraensäure durch Flächenvergleich mit identischem externen Standard bestimmt.

4.5.2. 12 - Hydroxieikosatetraensäure:

Wie oben beschrieben (unter 4.2) werden gewaschene Thrombozyten hergestellt. Eine Einstellung erfolgt jedoch nicht, sondern die Thrombozyten werden nur - wie beschrieben - gezählt.

In einem möglichst geringen Volumen werden 1, 2, 4, 8 und 16 mal 107 Thrombozyten mit jeweils 50 µg Arachidonsäure versetzt. Nach der Inkubation von 60 min bei 37°C wird die Reaktion durch Einstellung des pH-Wertes mit konz. Essigsäure auf einen Wert von 3 beendet.

Aus jeder Probe werden 20 µl auf die HPLC gegeben und der Gehalt an 12 - Hydroxieikosatetraensäure bestimmt.